Ana Fark - PCR ve QPCR

PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) ve qPCR (kantitatif PCR), DNA'yı çeşitli amaçlarla çoğaltmak için biyoteknolojide kullanılan iki tekniktir. PCR nispeten basit bir tekniktir. qPCR olarak da bilinir gerçek zamanlı PCR veya dijital PCR. NS asıl fark PCR ve qPCR arasındaki PCR nitel bir tekniktir, qPCR ise nicel bir tekniktir. PCR sonucun “varlık veya yokluk” olarak okunmasına izin verir. Ancak qPCR'de her döngüde amplifiye edilen DNA miktarı ölçülür. PCR'de RNA kullanılıyorsa teknik RT-PCR (ters transkripsiyon PCR) olarak bilinir ve qPCR'de RNA kullanılıyorsa teknik qRT-PC olarak bilinir.

Kapsanan Kilit Alanlar

1. PCR nedir - Tanım, Süreçler, Kullanımlar 2. QPCR Nedir? - Tanım, Süreçler, Kullanımlar 3. PCR ve QPCR Arasındaki Benzerlikler Nelerdir? - Ortak Özelliklerin Anahatları 4. PCR ve QPCR Arasındaki Fark Nedir? – Temel Farklılıkların Karşılaştırılması

Anahtar Terimler: Agaroz Jel Elektroforezi, Amplikonlar, DNA polimeraz, Floresan Boya, PCR, Problar, qPCR, RT-qPCR

PCR nedir

PCR, seçilen bir DNA segmentini çoğaltarak kısa bir DNA dizisinin analizine izin veren biyoteknolojideki bir tekniği ifade eder. Tek bir reaksiyon için çok küçük hacimler gerektiğinden nispeten hassas bir yöntemdir. Teknik, DNA polimerazın, tamamlayıcı bir şekilde sunulan şablon iplikçik için yeni DNA ipliklerini sentezleme kabiliyetine dayanmaktadır. PCR'nin reaksiyon karışımı, DNA polimeraz, DNA nükleotidleri, primerler, amplifiye edilecek DNA şablonu ve magnezyumdan oluşur. Amplifikasyon, bir termocycler içinde gerçekleştirilir. Bu reaksiyonda yüksek sıcaklıklar kullanıldığından DNA polimeraz ısıya dayanıklı olmalıdır. PCR'de kullanılan iki tip DNA polimeraz, Taq DNA polimeraz ve Pfu DNA polimerazdır. Taq DNA polimeraz, PCR'de yaygın olarak kullanılmaktadır.

DNA polimeraz, yeni bir iplikçik sentezlemek için 3' ucunda önceden var olan bir DNA ipliği gerektirir. Bu nedenle, DNA sentezinin başlatılması için reaksiyon karışımına bir oligonükleotit primeri eklenir. PCR'de bir primer gereksinimi, şablonda yalnızca belirli bir bölgenin amplifikasyonuna izin verir. Hedef dizi, ileri ve geri primerlerle çevrilidir. PCR'nin sonunda, belirli bir DNA dizisinin yeni kopyaları denir. amplikonlar, milyarlarca birikir. PCR'nin bileşenleri, arızayı en aza indirirken PCR performansını iyileştirecek şekilde optimize edilmelidir. Standart PCR reaksiyonu, şekil 1'de gösterilmiştir.

Şekil 1: PCR

PCR Adımları

Bir PCR'nin üç adımı aşağıda açıklanmıştır.

1. denatürasyon – Çift sarmallı DNA şablonu, 94-95 °C'ye ısıtılarak iki tek sarmal halinde ayrılır.
2. tavlama – İleri ve geri primerler, şablondaki tamamlayıcı dizilere bağlanır. Sıcaklık, astar kombinasyonunun erime sıcaklığına bağlıdır.
3. Astar uzatma – DNA polimeraz enzimi, büyüyen zincire tamamlayıcı bazlar ekleyerek her bir primeri 3' ucunda uzatır. Uzatma adımında sıcaklık olarak Taq polimerazın optimum sıcaklığı, yani 72 °C kullanılır. Uzatmanın süresi, şablon dizisindeki baz çiftlerinin sayısına bağlıdır.

Üç adım 28-35 kez tekrarlanır. Agaroz jel elektroforezi, PCR ürünlerinin boyut fraksiyonasyonunda kullanılır. Ürün etidyum bromür ile boyanır ve UV altında gözlemlenir. PCR ürünü veya amplifiye DNA, klonlama, dizileme veya genotiplendirmede kullanılabilir.

QPCR nedir?

QPCR, biyoteknolojide, çeşitli uygulamalar için nükleik asitlerin saptanmasına, karakterizasyonuna ve nicelenmesine izin veren bir tekniği ifade eder. Bu nedenle, bir tür kantitatif PCR'dir. Hem DNA hem de RNA, qPCR olarak kullanılabilir. Şablon olarak RNA kullanılıyorsa, önce cDNA'ya ters kopyalanmalıdır. Bu nedenle, bu tür qPCR olarak bilinir RT-qPCR. Geleneksel PCR, cDNA veya olağan DNA örneği için gerçekleştirilir. Ancak, qPCR'de, PCR döngüsünün her adımında PCR ürününü etiketlemek için floresan boyalar kullanılır. Bu, PCR ilerledikçe verilerin toplanmasını sağlar ve PCR'nin üstel fazı sırasında amplikonların nicelleştirilmesine izin verir. qPCR'de kullanılan ana boya türü SYBR Green'dir. Boya, çift sarmallı DNA'ya bağlanır. Floresans, amplifiye DNA miktarı ile orantılı olarak arttığından, miktar tayini “gerçek zamanlı” olarak yapılabilir. Boya kullanımının ana dezavantajı, numunedeki belirli bir ürünün miktarının belirlenmesine izin vermesidir. Boyalara ek olarak, kantifikasyon işleminde problar da kullanılabilir. TaqMan probları, qPCR'de kullanılan ana oligonükleotid prob tiplerinden biridir ve floresan emisyon süreci Şekil 2'de gösterilmektedir.

Şekil 2: TaqMan Probu

Problar, aynı numune içindeki birkaç PCR ürününü tespit edecek şekilde tasarlanabilir. TaqMan probu, hidroliz problarının ana tiplerinden biridir; bu probun PCR ürününe dahil edilmesi, floresan yayan floroforu açığa çıkarır. Floresan boyalar daha çok PCR ürününe özgüdür. Bu nedenle, PCR ürününü saptamak için çoğu tanısal tahlilde kullanılırlar.

PCR ve QPCR Arasındaki Benzerlikler

PCR ve QPCR Arasındaki Fark

Tanım

PCR: PCR, seçilen bir DNA segmentini çoğaltarak kısa bir DNA dizisinin analizine izin veren biyoteknolojide bir tekniktir.

QPCR: QPCR, çeşitli uygulamalar için nükleik asitlerin saptanmasına, karakterizasyonuna ve nicelleştirilmesine izin veren biyoteknolojide bir tekniktir.

Nicel/Nitel

PCR: PCR kalitatif bir tekniktir.

QPCR: QPCR nicel bir tekniktir.

Ürün Tespiti

PCR: Ürün, PCR'de agaroz jel elektroforezi ile tespit edilir.

QPCR: Ürün, qPCR'deki her amplifikasyon döngüsünde saptanabilir.

Veri Toplama

PCR: Veriler, PCR'de reaksiyonun sonunda toplanır.

QPCR: Veriler, qPCR'de reaksiyonun üstel fazı sırasında toplanır.

Çözünürlük

PCR: PCR çok zayıf bir çözünürlüğe sahiptir.

QPCR: QPCR çok yüksek bir çözünürlüğe sahiptir.

boyalar

PCR: PCR, ürünü PCR sırasında boyamak için etidyum bromür kullanır.

QPCR: QPCR, ürünü algılamak için floresan boyalar kullanır.

Zaman

PCR: PCR daha fazla zaman alan bir yöntemdir.

QPCR: QPCR daha az zaman alır.

RNA

PCR: RT-PCR, şablon olarak RNA kullanan PCR türüdür.

QPCR: RT-qPCR, şablon olarak RNA kullanan qPCR türüdür.

rol

PCR: PCR, belirli genomik fragmanların varlığını veya yokluğunu tespit etmek için kullanılır.

QPCR: QPCR, bir numunedeki belirli bir parçayı ölçmek için kullanılır.

Çözüm

PCR ve qPCR, biyoteknolojide DNA'yı çeşitli amaçlarla çoğaltmak için kullanılan iki tür tekniktir. PCR, bir DNA fragmanının varlığını veya yokluğunu belirlemek için kullanılan geleneksel amplifikasyon yöntemidir. QPCR, bir numunedeki belirli bir parçayı ölçmek için kullanılır. Bu nedenle, PCR nitel bir tekniktir, qPCR ise nicel bir tekniktir. PCR ve qPCR arasındaki temel fark budur.

Referans:

1. “QPCR ve Dijital PCR ve Geleneksel PCR” Thermo Fisher Scientific, Buradan ulaşabilirsiniz.

Görünüm inceliği:

1. “PCR” Madprime Tarafından – Commons Wikimedia2 aracılığıyla kendi çalışmanız (CC BY-SA 3.0). "Takman" Kullanıcı Tarafından: Beyin Hasarlı - Orijinal yükleyicinin (Public Domain) Commons Wikimedia aracılığıyla kendi çalışması