Ana Fark - PCR ve RT-PCR

PCR ve RT-PCR moleküler biyolojide iki önemli tekniktir. PCR 1980'lerde Kary Mullis tarafından geliştirilmiştir. Belirli bir genin kopya sayısını üstel bir şekilde artırarak o belirli DNA parçasının tespitini kolaylaştırabilir. Taq Polimeraz, PCR sistemlerinde en sık kullanılan enzimdir. Termostabil bir enzimdir. RT-PCR'de ters transkripsiyonu PCR takip eder. Enzim, ters transkriptaz, RNA'dan tamamlayıcı DNA'nın sentezinde yer alır. NS asıl fark PCR ve RT-PCR arasındaki PCR, şablon olarak çift sarmallı DNA'yı kullanırken RT-PCR, şablon olarak RNA'yı kullanır.

Kapsanan Kilit Alanlar

1. PCR nedir - Tanım, Süreç, Uygulama 2. RT PCR Nedir? - Tanım, Özellikler, Uygulama 3. PCR ve RT PCR arasındaki fark nedir? – Temel Farklılıkların Karşılaştırılması

Anahtar Terimler: PCR, RT-PCR, Polimeraz Zincir Reaksiyonu, Ters Transkripsiyon-Polimeraz Zincir Reaksiyonu, DNA Şablonu, DNA Polimeraz, Denatürasyon, Tavlama, Primer Uzatma

PCR nedir

PCR (Polimeraz zincirleme reaksiyonu) nispeten basit ama devrim niteliğinde bir yöntemdir. PCR, DNA polimeraz enziminin, sunulan şablon ipliği tamamlayıcı bir şekilde yeni DNA ipliklerini sentezleme yeteneğini kullanır. PCR, genlerin fonksiyonel analizi, kalıtsal hastalıkların teşhisi ve izlenmesi, DNA klonlama, dizileme ve eski DNA amplifikasyonu için hem klinik hem de araştırma laboratuvarlarında kullanılan vazgeçilmez bir tekniktir. DNA şablonu, nükleotidler, primerler ve DNA polimeraz, PCR'nin dört ana bileşenidir. NS DNA şablonu genellikle, amplifiye edilecek olan hedef diziye sahip çift sarmallı bir DNA'dır. Taq DNA polimeraz Thermus aquatics'ten izole edilen, PCR'de yaygın olarak kullanılmaktadır. NS Pfu DNA polimeraz yüksek sadakate sahip başka bir DNA polimeraz türüdür. Hem Taq hem de Pfu polimerazlar ısıya dayanıklıdır. DNA polimerazları tarafından eklenen nükleotidler adenin (A), guanin (G), sitozin (C) ve timindir (T). DNA polimeraz, önceden var olan bir DNA zincirinin 3' ucuna sadece yeni bir nükleotit ekleyebildiğinden, DNA sentezinin başlatılması için bir oligonükleotit primeri gereklidir. PCR'de bir primer gereksinimi, şablonda yalnızca belirli bir bölgenin tanımlanmasına izin verir. Hedef dizi, ileri ve geri primerlerle çevrilidir. Bir PCR'nin sonunda, belirli bir DNA dizisinin amplikonları adı verilen yeni kopyalar milyarlarca birikir. PCR'nin bileşenleri, arızayı en aza indirirken PCR performansını iyileştirecek şekilde optimize edilmelidir.

PCR, farklı sıcaklıklar arasında geçiş yapabilen termal döngüleyiciler tarafından yapılan otomatik bir işlemdir. PCR üç aşamalı bir işlemdir.

1. denatürasyon – Çift sarmallı DNA şablonu, 94-95 °C'ye ısıtılarak iki tek sarmal halinde ayrılır.
2. tavlama – İleri ve geri primerler, şablondaki tamamlayıcı dizilere bağlanır. Bu adımın sıcaklığı, astar kombinasyonunun erime sıcaklığına bağlıdır.
3. Astar uzatma – DNA polimeraz enzimi, büyüyen zincire tamamlayıcı bazlar ekleyerek primerlerin her birini 3' ucunda uzatır. Uzatma adımında sıcaklık olarak Taq polimerazın optimum sıcaklığı olan 72 °C kullanılır. Uzatmanın süresi, şablon dizisindeki baz çiftlerinin sayısına bağlıdır.

Üç adım 28-35 kez tekrarlanır.

Şekil 1: Polimeraz Zincir Reaksiyonu

PCR ürünleri, bir DNA merdivenine kıyasla agaroz jel elektroforezi ile boyut fraksiyonlarına ayrılır. DNA'nın bir agaroz jel üzerinde görselleştirilmesi, etidyum bromür ile boyanarak ve UV altında gözlemlenerek yapılır. Bir etidyum bromür lekeli jelde UV altında amplifiye edilmiş DNA bantları şekil 2'de gösterilmektedir. DNA merdiveni en soldaki kuyuda gösterilmektedir.

Şekil 2: DNA bantları

RT-PCR Nedir?

RT-PCR (Ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu) mRNA tespiti için kullanılan en hassas tekniklerden biridir. RNA, normal bir dokunun gen ifadesi veya enfekte olmuş bir dokunun gen ifadesi hakkında bilgi toplamak için uygun şablondur. RT-PCR için şablon sırasıyla toplam RNA veya viral veya bakteriyel RNA olabilir. RNA, ters transkriptaz enzimi tarafından tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) ters kopyalanır. Ters transkriptazın optimum sıcaklığı 46 °C'dir. cDNA, ürünü elde etmek için PCR'de kullanılır. Ters transkripsiyon PCR'sindeki adımlar, şekil 3'te gösterilmektedir.

Şekil 3: RT-PCR

RT-PCR, iki aşamalı veya tek aşamalı reaksiyonlarda gerçekleştirilebilir. İki aşamalı reaksiyonda, ters transkripsiyon ve PCR, iki ayrı adımda gerçekleştirilir. Tek adımlı RT-PCR'de, ters transkripsiyonun ardından PCR, tek bir tüpte sıralı bir şekilde yapılır. Hem cDNA hem de nihai PCR ürünü, boyut ayırma ve görselleştirme amaçları için bir agaroz jel üzerinde çalıştırılabilir. Tek adımlı ve iki adımlı RT-PCR, şekil 4'te gösterilmektedir.

Şekil 4: Tek adımlı ve iki adımlı RT-PCR

PCR ve RT-PCR Arasındaki Fark

Tanım

PCR: PCR, moleküler biyolojide, bir DNA dizisinin milyonlarca kopyasını üreten bir DNA segmentini amplifiye etmek için kullanılan bir tekniktir.

RT-PCR: RT-PCR, moleküler biyolojide gen ekspresyonunun saptanmasında kullanılan bir PCR çeşididir.

adımlar

PCR: Denatürasyon, tavlama ve uzatma, PCR'deki üç adımdır.

RT-PCR: RT-PCR'de ters transkripsiyonu PCR takip eder.

Şablon

PCR: Çift sarmallı bir DNA molekülü, PCR için şablon görevi görür.

RT-PCR: Tek sarmallı bir RNA molekülü, ters transkripsiyon için şablon görevi görür. Tek zincirli bir DNA molekülü, PCR için şablon görevi görür.

Kullanılan Enzimler

PCR: PCR'de enzim olarak DNA polimeraz kullanılır.

RT-PCR: RT-PCR'de enzim olarak ters transkriptaz ve DNA polimeraz kullanılır.

Primerler

PCR: PCR'de ileri ve geri primerler kullanılır.

RT-PCR: Ters transkripsiyon için sadece ters primer kullanılır ve PCR'de hem ileri hem de ters primerler kullanılır.

Duyarlılık

PCR: PCR hassas bir yöntemdir.

RT-PCR: RT-PCR, PCR'den daha hassastır.

Uygulamalar

PCR: PCR, genlerin fonksiyonel analizinde, kalıtsal hastalıkların teşhisinde ve izlenmesinde, DNA klonlamada, DNA dizilemesinde ve eski DNA amplifikasyonunda kullanılır.

RT-PCR: RT-PCR, gen ekspresyonunun tespitinde kullanılır.

Çözüm

PCR ve RT-PCR, moleküler biyolojide kullanılan iki önemli tekniktir. Hem PCR hem de RT-PCR, ileri ve geri primerler tarafından tanımlanan bir hedef DNA dizisinin kopya sayısını katlanarak artırma yeteneğine sahip otomatik tekniklerdir. PCR'de şablon olarak çift sarmallı DNA kullanılır. PCR ile DNA klonlama, DNA dizileme ve genlerin fonksiyonel analizi yapılabilmektedir. RT-PCR'de, belirli bir dokudaki gen ekspresyonu, RNA'nın amplifiye edilmesiyle gözlemlenebilir. PCR ve RT-PCR arasındaki temel fark, her reaksiyonda ve uygulamalarında kullanılan şablonlarındadır.

Referans:

1. "Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)." Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi. ABD Ulusal Tıp Kütüphanesi, n.d. Ağ. Burada mevcut. 01 Haziran 2017. 2. “Polimeraz Zincir Reaksiyonu (veya PCR).” Genlerin Klonlanması ve Moleküler Analizi. N.p., n.d. Ağ. Burada mevcut. 01 Haziran 2017. 3. Biolabs, New England. “CDNA Sentezi ve RT-PCR.” CDNA Sentezi ve RT-PCR | NEB. N.p., n.d. Ağ. Burada mevcut. 01 Haziran 2017.

Görünüm inceliği:

1. "Polimeraz zincir reaksiyonu" Enzoklop tarafından - Commons Wikimedia aracılığıyla kendi çalışması (CC BY-SA 3.0) 2. "DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis." Rainis Venta tarafından – Commons Wikimedia aracılığıyla kendi çalışması (CC BY-SA 3.0) 3. “Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu” Jpark623 tarafından – Commons Wikimedia aracılığıyla kendi çalışması (CC BY-SA 3.0) 4. “Bir adıma karşı iki adım RT-PCR” Jpark623 tarafından - Commons Wikimedia aracılığıyla kendi çalışmanız (CC BY-SA 3.0)